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我院苏建亚教授团队揭示甜菜夜蛾多药抗性的调控机制

发布时间:2021-03-19    点击量:


202139日,南京农业大学苏建亚教授团队在知名期刊PLoS Genetics在线刊发了题为 “Changes in both trans- and cis-regulatory elements mediate insecticide resistance in a lepidopteron pest, Spodoptera exigua的研究论文。论文综合解析了甜菜夜蛾对毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯等多种杀虫剂产生抗性的原因,揭示了反式作用因子与顺式调控元件协同调控解毒酶基因组成型表达上调,并介导多药抗性的分子机理。

细胞色素P450的过量表达是害虫对杀虫剂产生抗性的重要原因。本文首先利用定量PCR比较了甜菜夜蛾抗性种群与敏感种群中P450基因的表达水平差异,在分析的68P450基因中,有21P450基因在抗性种群中上调表达,其中以CYP321A8在抗性种群中表达上调最显著,较敏感种群上调了306倍。作者进一步利用GAL4/UAS二元表达系统将CYP321A8在果蝇中异源表达,发现表达CYP321A8提高了果蝇对毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯等杀虫剂的抗性。同时,利用真核表达技术对CYP321A8进行了体外表达,体外代谢试验也证明该基因编码蛋白对这些杀虫剂都具有降解能力。说明单一CYP321A8基因的高表达足以导致害虫对多种杀虫剂产生抗性。

为了阐明抗性种群中CYP321A8基因高表达的机制,比较分析了抗性种群与敏感种群之间该基因的上游调控序列差异,发现该基因的上游调控序列中含有转录因子(CncC/Maf)的2个结合位点。经荧光报告活性分析,结合点突变分析,验证了这2个结合位点的转录活性,尤其以近端位点的转录活性更高。进一步发现抗性品系中CncC/Maf的表达水平显著高于敏感品系,是高表达的CncC/Maf促进了转录水平的升高(4.7倍),此为调控机制之一。

作者进一步分析了抗/感品系之间CYP321A8基因上游调控序列的差异,发现敏感品系的上游序列存在明显的多态性,而抗性品系的该基因上游序列已丧失了这种多态性,仅1种类型。为确定抗性品系中是什么原因导致该基因的上调表达,作者通过制备一系列不同的截短型报告质粒,将转录活性区域定位到-385~-142之间的243个碱基范围内。在这243个碱基区域抗性品系有5个突变,分别对这5个位点进行回复突变(恢复成敏感品系中的碱基),发现仅M5的回复突变使转录活性显著下降,其他4个位点的突变不影响转录活性,说明M5的突变与CYP321A8的上调表达有关。序列分析发现,M5突变导致形成了另一转录因子(Knirps)的结合位点,而敏感品系的该基因上游调控序列中没有这一转录因子的结合位点。荧光报告活性分析也表明, Knirps可显著提高抗性品系该基因上游调控序列的转录活性,而不能影响敏感品系该基因上游调控序列的转录活性。抗/感品系之间KnirpsmRNA表达水平是没有差异的,说明抗性品系中CYP321A8高表达的原因之一,是其上游调控序列的突变形成了Knirps结合位点,可招募转录因子Knirps与之结合,从而使转录活性上升了 9.1倍。

综上所述,介导甜菜夜蛾多药抗性的CYP321A8基因高表达涉及2种独立的机制:转录因子(CncC/Maf)的上调表达,以及调控区突变形成新的转录因子结合位点,二种机制协同作用促进了CYP321A8基因在抗性品系中的高表达。更有意思的是二者协同对促进转录具有增效作用,转录活性增加41倍,而单独作用下增加的转录活性分别是4.7倍与9.1倍。本研究首次提供了不同转录机制之间的协同作用,并增效调控基因表达的实例。

文章第一作者为南京农业大学博士生胡波,南京农业大学苏建亚教授和肯塔基大学Subba Reddy Palli教授为共同通讯作者,埃克塞特大学Chris Bass教授参与论文的修改润色。项目研究由国家自然科学基金(3200033332072452)与江苏省研究生科研创新计划(BE2019396)资助。

论文全文链接:https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009403